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PCR实验室规划设计与防污染措施

发布时间:2020-06-18

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一、 PCR实验室规划设计

如何建一个标准的PCR 实验室?PCR实验室如何设计规划才堪称专业?PCR实验室管理又有哪些注意要点?

标准的PCR 实验室分为四个区域,分别为:

n1.试剂配制区; 

n2.样品处理区; 

n3.核酸扩增区;

n4.产物分析区;

如使用全自动分析仪,区域可适当合并。(进入各工作区域必须严格按照单一方向进行,不同的工作区域使用不同的工作服,例如不同的颜色。工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出) 

PCR实验室平面布局

【各区的功能分别为】

试剂准备区:扩增试剂的配制、分装和保存。     

样品处理区:样品登记、分装;核酸提取、保存和加样。    

扩增产物分析区:扩增产物的测定、结果分析、登记及报告。  

扩增前区与扩增后区应严格分开,须使用不同的房间,两区之间最好有一定的间隔。 

使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。     

在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内:    

在生物安全柜内操作;     

每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗材;    

盛放污染材料的器皿密封并一次性使用;  

用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。

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PCR实验室建设规划要点

1、主体结构: 

主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。

2、标准的三区分隔和气压调节:

将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。

可打开缓冲区Ⅰ,缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。

3、 消毒:

在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。

在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。

4、机械连锁不锈钢传递窗:

试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流) 

5、 地面

地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm。

6、照明

灯具要选用VS灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。

在建设的过程中应注意

●规范的安装流程和全面的服务流程。 

●严格按照规范科学设计的安装流程。

●安装前需要确定以下安装条件,如:电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水压,最小安装空间,地面平整度,VS孔、进水管和下水管的位置等,理想状态的空间尺寸和VS口尺寸。

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设计要点

PCR实验室可以是分散形式,也可以是组合形式。完成一组PCR实验,通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程,若实验工艺需要,还应增加样品粉碎过程。

一、分散形式PCR实验室

所谓分散形式PCR实验室,是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远,呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验室,由于各个实验之间不易相互干扰,因此无需特殊条件要求。

二、组合形式PCR实验室

所谓组合形式PCR实验室, 是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置,组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室,由于各个实验间集中布置,容易造成相互干扰,因此,对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间,以减少室内外空气交换。

一些经验:

试剂配制室及样品处理室宜呈微正压,以防外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染;

可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。

核酸扩增室及产物分析室应呈微负压,以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品,可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。 

在理想情况下,PCR实验室缓冲间内,可设置正压,使室内空气不流向室外,室外空气不流向室内。PCR实验室进风由原有中央空调控制,要求将中央空调风口安装到指定定点,且高度为地面铺装好后2600mm处。

如果使用荧光PCR仪,扩增室和产物分析室可以合并。

若房间进深允许,可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面,缓冲间比专用走廊更有意义。

各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流,形成单向流程的保护屏障,避免实验之间的相互干扰,防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。

实验室的墙体,包括顶棚,应结构牢固、气密性好;所有阴角宜采用圆弧形线条过渡;墙体内壁光洁、不年、耐腐蚀、易清洗消毒;地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。

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PCR实验室主要设备

试剂准备区 

仪器设备主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平和离心机等,加样器、天平除了要专用外,还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行  扩增反应混合液应使用分子生物学级的,试剂制备好后应有质检:一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。

标本制备区 

仪器设备主要有生物安全柜、加样器、离心机、温育仪、混匀器等 

扩增区 

扩增区的主要仪器是核酸扩增仪、超净台、微量加样器、离心机、可移动紫外灯。扩增仪需进行校准。并配备UPS电源,以防止由于电压的波动,停电对扩增效果的影响。

分析区 

本区所使用的仪器设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等 洁净实验区的缓冲间部分面积不能超过主实验室的八分之一,这是有规定的。 

一些琐碎的、不可忽略的设计

1.实验室空调VS系统设计及压力控制 

PCR实验室并没有严格的VS要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

2.污染的预防与控制  

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染,实验就必须停止,直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。

PCR实验室不可缺少的严格管理

(1)严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室,有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门; 

(2)尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。 

(3)扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等; 

(4)扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,应特别注意实验人员的安全防护。3.5完备的实验室配套设施  完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件,应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器,如超净工作台、离心机、加样器等。

二、 PCR实验室防污染措施及应急处理方法

污染,是PCR实验室出现实验假阳性、结果不可信、研发不可靠的重要推手,PCR实验室应当将防污染作为日常管理、实验安排、清洁消毒、实验习惯的核心。PCR 实验污染和细胞污染是有差别的,PCR 实验污染主要是核酸而不是细菌和其他入侵者。因此所有的预防措施都会稍稍有所不同。“易查不易察”,污染来的悄无声息,我们该如何应对。今天给大家简单介绍一下PCR实验室的主要污染来源、实验中如何避免和减少污染的可能性及实验发生污染的应急处理方案。

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PCR实验室的污染来源

1、样本间交叉污染:

收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢;不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖;移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌;不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散,相互交叉污染。

2、实验试剂污染:

主要是在 PCR 组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。 加样过程中,因为 PCR 试剂对温度十分敏感,需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃,但这个过程也是充满了污染的风险的。

3、扩增产物污染:

大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖,这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的 PCR 产物污染,就可形成假阳性。

4、克隆质粒污染:

作为阳性质控品的克隆质粒外溢。

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PCR实验室的防污染方法

按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序,所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。

1、严格执行各区功能划分:

试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。

扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品,包括移液器等器具应专用,空气、物品流向依次为:试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区,不可逆行。

2、清洁的实验用品:

实验室自配试剂(去离子水、缓冲液等)和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。

3、正确的实验操作:

实验应在超净工作台内进行,工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。

实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换,在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套,以避免不同实验区交叉污染。

装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心,将管壁及管盖上的液体离至管底,降低污染手套或加样器的风险;谨慎开启反应管,防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。

吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行,遵守“慢吸快打”原则,尽量一次性完成,忌多次抽吸,以避免气溶胶产生的交叉污染。

PCR试剂建议小量分装,以减少反复冻融、重复取样次数;多样本PCR反应时,先配制反应混合液分装至反应管中,最后加入样本核酸,请勿同时开盖,尽量保证单人单管,实现完全闭管操作。

实验试剂应与样品和PCR产物分开保存,不应放于同处。

PCR扩增实验完成后及时将反应管取出,用一次性手套将产物反应管包裹丢弃,保证管盖紧闭。

4、规范的实验设计:

应遵循实验室内部质量控制的相关规定,实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照,全程质控实验过程,验证PCR反应的可靠性,并协助判断扩增系统的可信性。

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PCR实验室的污染应急处理方法

1、若核酸样本溢出:

立即用布或纸巾覆盖,由外围向中心倾倒10%的次氯酸消毒剂,约30分钟后,清除污染物品,再用次氯酸消毒剂擦拭,并用75%酒精喷洒,移动紫外车定点照射1小时。

2、其他不明情况污染:

1、暂停所有实验操作;

2、清理实验室内所有物品,寻找污染来源;

3、加大实验室的VS;

4、对实验室内所有表面(台面、地面及墙面) 进行消毒;

5、75%酒精空中喷雾;

6、开启紫外消毒装置,延长紫外照射时间(4小时以上);

7、以上措施每日进行,直至污染消除;用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测,连续3次均阴性后方可进行常规检测。

PCR污染的范围很广,不同楼层也会产生影响,甚至会影响相邻建筑;PCR污染的时间很长,几个月甚至半年;PCR污染的影响很深,影响我们的生产计划,阻碍我们的研发进度,直接造成公司人力、财力的损失。但随着新技术和一些问题的明晰,无污染PCR检测的那一天离我们会越来越近!

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